云南红豆杉树皮中紫杉醇的含量最高,根中最少

作者:红豆杉 更新时间:2011/12/8 9:55:46 来源:云南红豆杉 【字号: 】 浏览

目的 研究云南红豆杉不同部位中紫杉醇的含量以及不同生长年限对云南红豆杉枝叶中紫杉醇含量的影响。

方法 采用HPLC法,Hypersil ODS2色谱柱,流动相为甲醇-乙腈-水(20∶30∶50),柱温30 ℃,检测波长227 nm,比较云南红豆杉的树皮、针叶、小枝和树根中紫杉醇的含量,以及不同生长年限对云南红豆杉枝叶中紫杉醇含量的影响。

结果 云南红豆杉树皮中紫杉醇的含量最高,根中最少,小枝、针叶中含量较高;随着生长年限的增加,云南红豆杉枝叶中紫杉醇的含量逐渐增加。

结论 云南红豆杉枝叶的采摘以5年生以上为佳。  
    紫杉醇是从红豆杉树皮中分离的一种二萜类化合物,能有效地治疗晚期乳腺癌、卵巢癌等,被认为是癌症治疗的重大进展之一。目前,市售紫杉醇主要从天然和栽培红豆杉中直接提取而得。紫杉醇资源极其有限,在树皮中的含量也仅为0.01~0.07%[1]。为充分利用资源,保护稀少树种,近几年来从其它部位提取紫杉醇正在受到关注。紫杉醇在植物体内含量还受多种因素的影响[2],有报道东北红豆杉枝叶生长年限越长含量越高,也有报道短叶红豆杉枝子越嫩含量越高。我们采用HPLC法考察了云南红豆杉(Taxus yunnanensis)不同部位中紫杉醇的含量,以及不同生长年限对云南红豆杉枝叶中紫杉醇含量的影响。
  1  材料
  1.1  仪器
     Angilent HP1100高效液相色谱仪;G1314A紫外检测器;KQ-500DE型超声仪;LG10-2.4A型医用离心机;固相萃取小柱(Accubond Ⅱ SPE ODS-C18 Cartridges, Agilent,12 mL);固相萃取装置(美国JTBaker公司)。
  1.2  药物  
  药材均采自云南大理云龙县,经南方医科大学生药室鉴定为云南红豆杉(Taxus yunnanensis Cheng et L.K.Fu)的树皮、根、枝叶。
  1.3  试剂
     紫杉醇(批号100382-200203),中国药品生物制品检定所提供;甲醇、乙腈为色谱纯,水为高纯水;其余试剂均为分析纯。
  2  方法及结果
  2.1  色谱条件
     色谱柱:Hypersil ODS(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相:甲醇-乙腈-水(20∶30∶50);柱温:30 ℃;流速:1.0 mL/min;检测波长:227 nm;进样量:10 μL。
  2.2  对照品溶液的制备
     精密称取紫杉醇对照品适量,加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作为对照品贮备液。
  2.3  线性关系考察
  精密量取以上对照品储备液,加甲醇配成浓度为0.004、0.01、0.03、0.05、0.08、0.12、0.3 mg/mL的对照品溶液。吸取上述对照品溶液各10 μL,分别注入液相色谱仪,按上述色谱条件进行分离,测得峰面积。将峰面积对进样量进行回归,得紫杉醇的回归曲线为:Y=2 252.517X+52.423(r=0.999 8),表明在0.04~3.0 μg之间呈线性关系。
  2.4  供试品溶液的制备
  供试样品自然干燥,粉碎成细粉,过60目筛,40 ℃减压干燥。称取药材细粉约2~4 g,精密称定,置具塞三角瓶中,加入乙酸乙酯-丙酮(1∶1)30 mL,25 ℃超声提取40 min,滤过,残渣再同法超声提取1次。合并上清液,减压蒸干,残渣加入石油醚(20 mL×3次),超声洗涤3次,离心分离。弃去石油醚液,残渣挥干石油醚,加入氯仿(20 mL×4次),超声振荡,离心分离。上清液合并,减压浓缩至干,作为待用样品。取固相萃取小柱,依次加入甲醇12 mL,抽干,0.01 mol/L的乙酸铵缓冲溶液12 mL,抽干。将样品溶于少量80%的乙酸铵甲醇溶液中,上柱,抽干,依次用0.01 mol/L的乙酸铵12 mL、50%的乙酸铵甲醇溶液12 mL淋洗,抽干,再加入80%的乙酸铵甲醇溶液12 mL洗脱,收集洗脱液,减压蒸发,残渣用甲醇溶解,定容至1 mL,甲醇液经0.45 μm微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。对照品和供试品图谱见图1。
      2.5  精密度试验
  取紫杉醇对照品溶液(0.050 4 mg/mL),重复进样5次,测得峰面积分别为1 381.736 2、1 379.435 3、1 375.796 6、1 384.467 2、1 360.445 6,RSD=0.69%,表明仪器精密度良好。
  2.6  稳定性试验
     取5年生枝叶供试品溶液,每隔2 h进样测定1次,共5次,测得其含量分别为0.062 8‰、0.063 2‰、0.063 7‰、0.064 2‰、0.063 4‰,RSD=0.83%,表明样品溶液在8 h内测定稳定。
  2.7  重复性试验   
  取5年生枝叶5份,按“2.4”项下方法分别提取,精制,测定,含量分别为0.063 4‰、0.064 1‰、0.063 9‰、0.062 6‰、0.061 3‰,RSD=1.81%。
  2.8  加样回收率试验   
  精密称取5年生枝叶1 g,置于100 mL锥形瓶中,分别加入浓度为0.012 mg/mL的紫杉醇对照品溶液5 mL,按“2.4” 项下方法制备供试品溶液,得5份供试品,分别对每份供试品按前述色谱条件进行测定。结果见表1。表1  紫杉醇加样回收率试验结果(略) 
  2.9  样品测定
     分别取5年生云南红豆杉的树皮、针叶、小枝和树根,按“2.4“项下方法制备供试品溶液,分别进样,测定。结果见表2。再分别取2年生、3年生、4年生、5年生云南红豆杉枝叶,按上述方法处理、测定。结果见表3。表2  云南红豆杉(5年生)不同部位中紫杉醇的含量测定结果(略)
表3  不同生长年限云南红豆杉枝叶中紫杉醇的含量测定结果(略)
  3  讨论
  3.1  药材提取溶剂的选择
     本实验曾试用了不同的溶剂进行提取,如甲醇、乙醇、氯仿、甲醇-二氯甲烷(1∶1)、乙酸乙酯-丙酮(1∶1),结果以乙酸乙酯-丙酮(1∶1)得膏率最低,提取率最高,提取2次就可以将紫杉醇提取完全。
  3.2  样品制备方法的选择
     紫杉醇枝叶中紫杉醇的含量相对较低,且含有大量的叶绿素,杂质不易去除,对药材的处理方法曾试用了液-液萃取法、硅藻土吸附法、过A12O3柱、硅胶柱、固相萃取等方法,过A12O3柱、硅胶柱、固相萃取均能使紫杉醇达到较好的分离,但是,过A12O3柱、硅胶柱后的样品杂质较多,影响色谱柱的使用寿命,因此选用了固相萃取的方法。
  3.3  色谱条件的选择
     紫杉醇和三尖杉宁碱结构比较相近,在液相色谱上的分离有一定难度,试验使用了苯基柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)、Hypersil ODS柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),结果以Hypersil ODS柱效果为好。流动相试用了甲醇-水(65∶35)、乙腈-水-四氢呋喃(25∶67∶8)、甲醇-乙腈-水(20∶30∶50),结果以甲醇-乙腈-水(20∶30∶50)系统最好。
  3.4  结果分析
  由表2可以看出,云南红豆杉树皮中紫杉醇的含量最高,根中最少,小枝、针叶中含量较高。但红豆杉植物生长缓慢,树皮量又少,而且剥去树皮会使树木死亡,长此以往必然导致资源枯竭。而红豆杉枝叶可以再生,且总量远远大于干皮,为保护资源,从云南红豆杉枝叶中获取紫杉醇具有重要的意义。由表3可知,随着生长年限的增加,云南红豆杉枝叶中紫杉醇的含量逐渐增加,因此枝叶的采摘以5年生以上为佳。

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